Dois anos se passaram desde que o universitário Peter Parker (Tobey Maguire) ganhou os poderes que o transformaram em Homem-Aranha, mas que também o separaram do grande amor de sua vida, Mary Jane Watson (Kirsten Dunst). Peter está em crise profissional – é despedido de seu emprego como emtregador de pizzas, e no jornal Clarim Diário seu chefe J. Jonah Jameson ( J.K. Simmons) o pressiona para obter fotos que desmoralizem o herói aracnídeo. Na vida pessoal as coisas não estão melhores, seu amor por M. J. o leva a questionar se deve ou não continuar sendo um herói. A grande amizade de Peter e Harry Osborn (James Franco) se complica diante da amargura do jovem Osborn com a morte de seu pai e seu desejo cada vez mais forte de se vingar do Aranha, a quem ele responsabiliza. As coisas se complicam quando Peter subitamente perde seus poderes e precisa enfrentar um novo e poderoso adversário, o cientista Otto Octavius (Alfred Molina), que após um acidente tornou-se o vilão Doutor Octopus – vulgo Doc Ock.